HPLC en massaspectrometrie: wat elk van de twee bewijst

Op vrijwel elk peptidecertificaat staan twee analyses, en het zijn geen alternatieven. Ze meten iets anders, en allebei zijn ze blind voor dingen die de ander juist opmerkt.

HPLC: hoe schoon, niet wát

Hogedrukvloeistofchromatografie duwt het opgeloste monster door een gepakte kolom. Verschillende moleculen reizen verschillend snel, dus komen ze op verschillende momenten van de kolom, en een detector legt vast wat er langskomt. De uitkomst is een chromatogram: een basislijn met pieken erop.

Zuiverheid is de oppervlakte van de hoofdpiek als aandeel van alle piekoppervlakte. Meer is het niet. De techniek zegt dat één ding het monster domineert — niet wélk ding. Een flesje met het verkeerde peptide, netjes gemaakt, geeft een prachtig chromatogram.

Er zitten nog twee grenzen aan die het weten waard zijn. Verontreinigingen die toevallig even snel reizen als de hoofdstof co-elueren: die liggen ónder de hoofdpiek en worden meegeteld. En het getal hangt af van de methode — kolom, gradiënt, temperatuur — dus twee laboratoria kunnen een andere zuiverheid melden voor hetzelfde materiaal zonder dat een van beide ongelijk heeft.

Massaspectrometrie: wát, binnen grenzen

Massaspectrometrie ioniseert het monster en meet de massa-ladingverhouding. Leg de gemeten massa naast de massa die uit de bedoelde volgorde volgt, en overeenstemming sluit veel uit: een andere stof, een keten waar resten aan ontbreken, een vervanging die de formule verandert.

Wat hij niet kan uitsluiten is alles wat de massa gelijk laat. Dezelfde aminozuren in een andere volgorde wegen precies evenveel. Leucine en isoleucine zijn verschillende aminozuren met dezelfde massa. Stereochemie — dezelfde atomen, gespiegeld — is er onzichtbaar voor.

Waarom allebei, en in welke volgorde

Neem ze apart en elk laat een duidelijk gat. Zuiverheid zonder identiteit: 99% zuiver, van iets. Identiteit zonder zuiverheid: het goede peptide, in een monster dat voor een derde bijproduct kan zijn. Samen beantwoorden ze de twee vragen die een koper werkelijk heeft, en daarom is een certificaat met één van de twee halverwege gestopt.

Waar je op het certificaat naar kijkt

• Allebei de analyses, niet één. Identiteit en zuiverheid zijn aparte vragen.
• Het chromatogram zelf, niet alleen het percentage. De grafiek laat zien waar de verontreinigingen zitten en hoe goed de pieken gescheiden zijn.
• De meetomstandigheden. Zonder kolom, gradiënt en golflengte is een zuiverheid niet na te doen en niet te vergelijken.
• Gemeten massa naast theoretische massa, als twee getallen en niet als een kaal oordeel.
• Het batchnummer op het certificaat dat overeenkomt met het nummer op het flesje in je hand.